|
|
Stanovení vybraných chemoterapeutik v extracelulárních vesikulech pomocí ICP hmotnostní spektrometrie
Kožnarová, Simona ; Hložková, Michaela (oponent) ; Vašinová Galiová, Michaela (vedoucí práce)
Extracelulární vesikuly jsou poměrně nově objeveným způsobem mezibuněčné komunikace. Problematika těchto membránou ohraničených váčků je stále značně neprobádaná, a to především na poli jejich role při nádorových onemocněních. Cílem této pilotní studie bylo pokusit se detekovat platinu ve vesikulech pomocí ICP-MS. Pro tento účel byly použity vzorky z buněčných linií nádorů ovarií, které byly vystaveny platinovým derivátům (typ chemoterapeutika). Tato metoda se ukázala jako schopná nejen platinu detekovat, ale i spolehlivě stanovit její koncentraci. Množství platiny ve vesikulech se pohybovalo kolem 1–2 % z celkově dodanému množství platiny do systému. Výsledky se lišily dle použitého platinového derivátu, buněčné linie a počtu buněk, kterými byly vesikuly uvolňovány. Nejvíce platiny bylo stanoveno ve vesikulech linie SK-OV-3, která je na tuto léčbu přirozeně rezistentní, a to u všech platinových derivátů. Využití ICP-MS je tedy vhodné i pro další výzkum této problematiky.
|
|
|
Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Soukup, Jakub
Priony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
|
|
|
Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Soukup, Jakub ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Šebestová Janoušková, Olga (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Priony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
|
|
|
Extracelulární váčky a střední T antigen myšího polyomaviru
Kropáček, Václav ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Brázdová, Andrea (oponent)
Tato práce se soustřeďuje na střední tumorový antigen (MT Ag) myšího polyomaviru (MPyV), potenciální důsledky jeho sekrece extracelulárními váčky (EVs) a jeho vliv na buněčnou signalizaci. MT Ag je membránově asociovaný protein schopný navodit nádorovou transformaci díky interferenci s buněčnou signální transdukcí, zejména aberantní aktivací MAP kinázové dráhy. V první části práce jsme proto navázali na předchozí pozorování provedená v rámci naší skupiny, ukazující, že střední T antigen může být sekretovaný z buněk extracelulárními váčky. Zajímalo nás, zda MT Ag může přispívat k transformaci recipientních buněk. Provedli jsme 2 typy izolace extracelulárních váčků z linií myších fibroblastů stabilně exprimujících střední T antigen (3T6MT) a prokázali jsme jeho přítomnost. Provedli jsme charakterizaci izolovaných EVs detekcí exosomálních markerů a kryo-elektronovou mikroskopií. Následně jsme vystavili recipientní buňky myších fibroblastů (3T6) izolovaným EVs a za pomoci průtokové cytometrie zjišťovali, zda došlo k internalizaci MT Ag. Zároveň jsme se pokusili detekovat, zda došlo u buněk vystavených EVs ke zvýšení hladiny fosforylace MAP kinázy Erk. Ve druhé části práce jsme se pokusili potvrdit a podrobněji analyzovat předešlé nepublikované pozorování zvýšené hladiny fosforylace jaderného faktoru...
|
|
|
Fenotyp melanocytů za fyziologických a patologických podmínek
Strnadová, Karolína ; Lacina, Lukáš (vedoucí práce) ; Mokrý, Jaroslav (oponent) ; Balvan, Jan (oponent)
Neopomenutelnými reprezentanty buněčných populací kůže, kromě dominantních keratinocytů a fibroblastů, jsou také melanocyty. Melanocyty jsou pigmentové buňky, jejichž primární funkcí je produkce pigmentu melaninu, který je důležitý pro ochranu keratinocytů před škodlivým ultrafialovým zářením. Nadměrné vystavení tomuto záření je rizikovým faktorem pro vznik kožních nádorů včetně maligního melanomu kůže, při kterém dochází k patologické transformaci melanocytů v buňky melanomu. Předložená disertační práce pojednává o studiu melanocytů a zaměřuje se na 4 tematické okruhy spojené zejména s jejich patologiemi. V prvním tematickém okruhu je do souvislostí dána zvyšující se incidence maligního melanomu kůže se stárnutím populace. Jednou z příčin se zdá být častější výskyt prozánětlivého ladění tkání ve stárnoucím organismu. Toto ladění připravuje vhodné prostředí pro vývoj nádoru. Druhý tematický okruh se orientuje na nové přístupy, které by mohly rozšířit škálu diagnostických metod pro časnou detekci maligního melanomu. První metodicky využívá detekci prozánětlivých molekul v těle pacienta, např. v době diagnózy. Bylo zjištěno, že vyšší sérové hladiny IL-6 nebo IL-8 korelují s nepříznivou prognózou pacienta. Druhý přístup se opírá o možnosti detekce nádorových buněk a možnosti jejich odlišení od buněk...
|
|
|
miRNA analýza malých extracelulárních vezikul izolovaných z plasmy po dietní intervenci
Kratochvílová, Michala ; Koc, Michal (vedoucí práce) ; Šrámek, Jan (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo zavedení protokolu izolace malých extracelulárních vezikul (sEV) z lidské plasmy. Vzorky plasmy byly odebírány od 44 zdravých žen, které v rámci klinické studie podstoupily dietní intervenci 60 h hladovění. Tyto ženy byly na základě BMI rozděleny do skupin hubené a obézní. Z plasmy odebrané před a po dietní intervenci byly metodou precipitace pomocí polyethylenglykolu vyizolovány sEV, které byly následně charakterizovány z hlediska jejich velikosti a koncentrace ve vzorku. U hubených i obézních žen byl počet sEV v plasmě stejný a nezměnil se ani v závislosti na dietní intervenci. V důsledku 60 h hladovění došlo ke změně velikosti sEV u skupiny hubených. Dalším cílem byla analýza miRNA exprese v sEV. Obsah sEV se v expresi některých analyzovaných miRNA lišil mezi skupinou hubených a obézních žen. Rozdíly byly pozorovány konkrétně v expresi hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p a hsa-let-7b-5p. 60 h hladovění vedlo ke zvýšené expresi hsa- miR-5100 u skupiny hubených a hsa-miR-27a-3p a hsa-miR-27b-3p u skupiny obézních. Tyto změny navozené dietní intervencí ale nebyly vyhodnoceny jako statisticky významné. Hladovění tedy ani u jedné skupiny nevedlo k výrazným změnám miRNA obsahu v sEV. Odlišné miRNA exprese byly patrné pouze mezi skupinami na základě rozdílného BMI. Klíčová...
|
|
|
Malé extracelulární váčky jako nosiče mikroRNA a jejich role v regeneraci nervových buněk
Šprincl, Vojtěch ; Romanyuk, Natalyia (vedoucí práce) ; Kriška, Ján (oponent)
Akutní poranění míchy je závažný typ úrazu, jehož léčba stále představuje výzvu pro současnou medicínu. Transplantace neurálních kmenových buněk (NSC) je jednou z mnoha nadějných cest, jak přispět k regeneraci poškozené tkáně. NSC komunikují se zbytkem tkáně pomocí malých extracelulárních váčků (sEVs), u kterých se tak předpokládá jejich regenerační potenciál. Cílem této diplomové práce je ověřit antiapoptotický účinek sEVs izolovaných z kultivačního média od dvou typů NSC na potkaním in vitro modelu poranění míchy. Pro splnění tohoto cíle byly nejprve otestovány různé způsoby izolací sEVs z kultivačního média. Následně byly sEVs charakterizovány podle jejich velikostí a přítomností povrchových markerů. Součástí práce byla PCR analýza obsahu neuroprotektivních a antiapoptotických miRNA uvnitř sEVs a fluorescenční barvení sEVs, kterým bylo dokázáno, že sEVs pronikají do cytoplazmy kmenových buněk. Nakonec byly sEVs aplikovány na potkaní in vitro model poranění míchy a pomocí metody imunoblotace byl prokázán jejich neuroprotektivní účinek. Klíčová slova Malé extracelulární váčky, exosomy, akutní poranění míchy, regenerace nervové tkáně, miRNA, mikroRNA, neurální kmenové buňky
|
|
|
Úloha exosomů u chronické myeloidní leukemie
Březinová, Lenka ; Krijt, Matyáš (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent)
Exosomy jsou extracelulární váčky o velikosti 30-150 nm, jejichž funkce je u chronické myeloidní leukemie (CML) zkoumaná kvůli jejich vlivu na proliferaci CML buněk, remodelaci kostní dřeně, angiogenezi a rezistenci na léčbu tyrosin-kinázovými inhibitory (TKIs). Ačkoliv byly vyvinuty účinné TKIs inhibující BCR-ABL kinázu, přesto zůstává 20-30 % pacientů na léčbu rezistentní. Rezistence CML buněk na léčbu je podporována exosomy. Exosomy přenášejí proteiny, nukleové kyseliny, chemokiny i malé molekuly, které podporují antiapoptotické, respektive tlumí proapoptotické procesy. Antiapoptotické procesy jsou podporovány zejména zvýšenými hladinami proteinů: TGF-β1, USP6 a FGF2 a různorodých zástupců RNA: miR-365, miR-21, Hsa_circ_0058493 a mRNA pro BCR-ABL. Snaha leukemických buněk je naopak snížit množství proapoptotických molekul, mezi které patří miR-320, miR-328 a miR-146a-5p. Leukemické buňky prostřednictvím exosomů modifikují mikroprostředí kostní dřeně tak, aby je podporovalo, a dále ovlivňují expresi adhezních a proangiogenních molekul. Důležitou roli v těchto procesech hrají miR-126, miR-210 a miR-92a. Vzhledem k variabilitě přenášených molekul není překvapující množství procesů ovlivněných CML exosomy ani jejich potenciální využití v léčbě CML, jak již bylo dokázáno v případě využití...
|
|
|
Role exosomů při virové infekci a vzniku rakoviny
Sekavová, Alžběta ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent)
Exosomy umožňují mezibuněčnou komunikaci a přenášení nákladu mezi buňkami. Znalost mechanismů třídění nákladu do exosomů a jejich přenosu mezi buňkami je zásadní pro vývoj vakcín a diagnostických přístupů. Exosomální přenos může přispívat jak k imunitní odpovědi organismu, tak k pathofyziologiím - zejména vzniku a rozvoji nádorových onemocnění a šíření virových infekcí. Výzkum role exosomů v životních cyklech tumorogenních virů přirozeně propojuje dosavadní poznatky o mechanismech virové karcinogenese a transportu buněčných i virových onkoproteinů a nukleových kyselin. Virus Epsteina a Barrové využívá exosomy pro přenos onkoproteinu LMP1 a regulačních RNA, zatímco virus lidské imunode- ficience využívá buněčné dráhy pro vznik exosomů k pučení z buňky zakrytý její membránou, která poskytuje úkryt před imunitním systémem. U viru hepatitidy C byl prokázán exosomální přenos infekčních částic. Onkoproteiny a virové RNA jsou v exosomech uvolňovány i z buněk infikovaných jinými lidskými tumorogenními viry. Mechanismy i důsledky těchto jevů však dosud zůstávají neprobádané. Klíčová slova: exosom, rakovina, virová infekce, tumorogenní viry, imunita, mezibuněčná komunikace, virus hepatitidy C, virus Epsteina a Barrové, virus lidské imunodeficience
|
|
|
Stanovení vybraných chemoterapeutik v extracelulárních vesikulech pomocí ICP hmotnostní spektrometrie
Kožnarová, Simona ; Hložková, Michaela (oponent) ; Vašinová Galiová, Michaela (vedoucí práce)
Extracelulární vesikuly jsou poměrně nově objeveným způsobem mezibuněčné komunikace. Problematika těchto membránou ohraničených váčků je stále značně neprobádaná, a to především na poli jejich role při nádorových onemocněních. Cílem této pilotní studie bylo pokusit se detekovat platinu ve vesikulech pomocí ICP-MS. Pro tento účel byly použity vzorky z buněčných linií nádorů ovarií, které byly vystaveny platinovým derivátům (typ chemoterapeutika). Tato metoda se ukázala jako schopná nejen platinu detekovat, ale i spolehlivě stanovit její koncentraci. Množství platiny ve vesikulech se pohybovalo kolem 1–2 % z celkově dodanému množství platiny do systému. Výsledky se lišily dle použitého platinového derivátu, buněčné linie a počtu buněk, kterými byly vesikuly uvolňovány. Nejvíce platiny bylo stanoveno ve vesikulech linie SK-OV-3, která je na tuto léčbu přirozeně rezistentní, a to u všech platinových derivátů. Využití ICP-MS je tedy vhodné i pro další výzkum této problematiky.
|
host ::
RSS.